超声和光声多模态成像应用于开颅窗后啮齿动物大脑

超声和光声多模态成像应用于开颅窗后啮齿动物大脑

探索成像新境界

关注“清湃光声”公众号

原文题目：A Skull-Removed Chronic CranialWindow for Ultrasound and
Photoacoustic Imaging of the
Rodent
Brain

原文作者：Xuanhao Wang, Yan Luo, Yuwen Chen, Chaoyi Chen, Lu Yin, Tengfei Yu, Wen Heand Cheng Ma

“超声和光声成像正成为研究大脑结构和功能的有力工具。颅骨通过带来明显的超声信号失真和衰减导致图像质量恶化。对于使用啮齿动物的生物学研究，经常通过开颅术提高图像质量。然而，开颅术需要保持长期的颅窗以防止重复手术。作者提出了一种小鼠模型来消除头骨顶部的声音阻塞，同时对成像物体产生最小的生理扰动。使用新小鼠模型，每次成像实验前不需要开颅。三种成像系统证实了我们方法的有效性：光声计算机断层扫描、超声成像和光声介观镜(Photoacoustic Mesoscopy)。对小鼠脑血流动力学进行了功能光声成像。我们期望通过新的小鼠模型实现光声和超声成像的新应用。”

01

—

动物模型

图1 慢性颅窗的创建过程(A-D)对应步骤1~步骤4。

步骤1

小鼠腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪溶液麻醉。然后将鼠标平卧放在手术台上，手术台加热以保持鼠标体温。用手术刀沿着大脑中线在头皮上切开一个10分钟的切口(图1A)。

步骤2

一对头皮固定器用于沿切口分离头皮。脑膜沿着矢状缝合线撕裂。然后用无菌拭子轻轻刮去颅骨上的脑膜，以最大限度地暴露骨头。颅骨钻孔器用于从冠状缝的底部钻孔，颅骨逐渐钻孔变薄并沿着冠状缝划沟，并且要小心防止颅骨被钻穿。然后，钻头沿着人字骨向下移动，进行相同的钻井操作。之后，钻头沿颅骨两侧移动，形成直径为10mm的闭合圆形凹槽(图1B)。

步骤3

在上一步中制作的槽的任何一点上轻轻钻一个点孔。然后用眼科镊子取出颅骨，露出大脑。需要非常小心，以避免对脑膜和大脑皮层造成任何损害。将无菌棉签反复涂抹在伤口周围，以阻止颅骨下毛细血管网出血(图1C)。

步骤4

取下头皮固定物，消毒后缝合头皮(图1D)。开颅手术后皮下注射20%(体积分数)的托非定溶液，参照剂量为0.1 ml/ 20g体重。这种手术是为了保护脑组织不被头骨和头皮上的伤口划伤。

这只老鼠被单独饲养在一个专用的笼子里，以避免意外的伤害。伤口3天就完全愈合了。持续恢复7天后拆线，小鼠准备进行影像学实验。每只有颅窗的小鼠与另一只相同年龄和体重的正常小鼠一起成像作为对照。请注意，处理过的小鼠在实验处理方面与正常小鼠相同。颅窗是由头皮永久创建和保护的，不会干扰老鼠的活动和大脑功能。

02

—

PACT体内成像

图2A给出了PACT系统和成像位置/视角的简化说明。

USI系统的原理图和成像位置如图2B所示。

光声介观镜装置示意图如图2C所示。

图2 成像系统示意图。(A)环形阵列PACT（光声）系统和鼠标头部俯视图。虚线标记成像的冠状面位置。TR：换能器阵列，FB：纤维束，FR：聚焦区域。(B) USI（超声）系统设置和鼠标头俯视图。虚线标记成像的冠状面位置。TR：换能器探头，AF：声焦平面。(C)光声介观系统和三个视角。

03

—

动物安全与健康状况验证

中脑和后脑代表性图像如图3A所示。尽管在颅窗内观察到轻微的大脑皮质突出，但整个大脑的结构仍然正常。然后对小鼠实施安乐死进行组织病理学检查，并用苏木精和伊红(H&E)染色大脑薄片，并在显微镜下观察。模型小鼠与对照组的比较如图3B所示。

图3 MRI和组织病理学结果。(A)正常小鼠(上一行)和模型小鼠(下一行)的MRI图像，左列为中脑，右列为后脑。(B)中脑冠状面不同区域H&E染色图像。

04

—

PACT成像结果

通过PACT成像实验验证了该模型的有效性。从额叶至中脑，取冠状面切片20张，步长250mm，颅腔放大图显示3个典型层(图4)。

图4 PACT成像结果。(A)平面的PACT图像，放大后为正常小鼠(左列)和小鼠模型(右列)。(B)平面图像：RRV、鼻侧静脉，AchA，前脉络膜动脉。(C)平面图像：LSCA、小脑外侧上动脉。(D) PACT图像中不同颜色标记的血管剖面图。

05

—

超声成像和PA-US双模态成像结果

我们获取了冠状面和矢状面超声图像(图5)。

图5 USI成像结果。(A)正常小鼠灰度图像，从左到右为图2B所示平面(A - C)。(B)与(A)在同一平面上的小鼠模型的灰度图像。(C)正常小鼠的多普勒图像。左侧显示灰度图像。在顶部和底部行中显示了两个不同的层。(D)小鼠模型在(C)同一平面上的多普勒图像。

图6为三个代表平面上对应灰度超声图像叠加的PACT图像。通过与正常小鼠图像的比较，可以观察到特征丰富度的显著提高。

图6 PA-US双模成像结果。PA图像为伪彩色，US图像为灰度作为背景。(A)小鼠模型在三个冠状面PA-US图像。(B)正常小鼠在(A)同一平面的PA-US图像。

06

—

光声显微成像结果

重建小鼠模型和正常小鼠的三维全脑成像结果并进行比较。每种情况都提供了不同的观察视角（图7）。

图7 光声显微镜系统及成像结果。(A)小鼠模型全脑成像结果。从上到下分别为图2C所示的视角的最大强度投影。(B)正常小鼠成像结果。

07

—

功能性脑血流动力学的PACT成像结果

PA成像结果显示，刺激后表现出信号增强的脑区与脑血管吻合良好(图8A、B)，证明检测到的功能信号是由血流动力学改变引起的。

图8 功能性脑血流动力学PACT成像结果。功能性血流动力学变化以伪彩色显示，结构图像以灰度作为背景。(A)无外界刺激(左)、左前爪刺激(中)、右前爪刺激(右)对应的中脑功能PACT图像。(B)图(A)所示三例后脑的功能性PACT图像。(C)图(A)所示三种不同情况下大脑中脑皮层总信号的相对变化。(D)后脑的图与图(C)相同。

08

—

总结

我们已经成功地将该技术应用于各种类别的实验小鼠，包括裸鼠(CD-1 nude, Balb/c nude)和普通实验室小鼠(CD-1, Balb/c)。目前，颅窗主要覆盖在小鼠颅骨的顶部。如果窗口可以延伸到部分打开颅骨两侧，则更可取。然而，预计这将扰乱正常活动并构成健康风险。在保证生物安全性的前提下，确定颅窗的尺寸限制需要进一步的研究。

DOI：10.3389/fnins.2021.673740.

来源：Frontiers in Neuroscience,2021, 15:
673740.

清湃光声