光声成像应用于新型原位合成纳米酶靶向结合肿瘤成像和光热治疗

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原文题目：In situ
synthesized nanozyme for photoacoustic-imaging-guided photothermal therapy and tumor hypoxia relief

原文作者：Chaoyi Chen,1
Yuwen Chen,1
Xuanhao Wang,1
Lulu Zhang,
Yan Luo,
Qingshuang Tang,Yuan Wang,
Xiaolong Liang,∗
and
Cheng Ma*

“
本研究提出了一种创新原位合成的纳米酶，其基于普鲁士蓝（PB）前驱体的智能纳米系统（ISSzyme）设计合成。ISSzyme能够与谷胱甘肽相互作用，在肿瘤特定位置合成PB纳米酶。这种新型纳米酶不仅能够实现肿瘤特异性光声成像（PAI）和光热治疗（PTT），有效降低了PAI的假阳性信号和PTT的潜在副作用。同时，ISSzyme展现了过氧化氢酶活性，能够缓解肿瘤缺氧，从而抑制肿瘤的转移。此外，由于原位合成的PB纳米酶在肝脏中的积累量较低，因此不会引起肝脏损伤。ISSzyme的研究为设计下一代人工酶提供了新的思路，并为开辟多种新的生物医学应用奠定了基础。”

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合成背景和原理

纳米酶在过去十年中因其类似酶的活性而备受研究关注，它们在成本、催化活性、多样化的酶样活性和稳定性方面展现出优于天然酶的优势。作为新一代人工酶，纳米酶在生物传感器和生物医学应用中具有巨大潜力。然而，多数纳米颗粒在代谢器官中的非特异性积累导致药物输送效率低下并可能损害正常器官。例如，纳米酶在富含吞噬细胞和50-200纳米孔隙的肝脏中积累，可能导致肝毒性、氧化还原平衡破坏，并对肿瘤治疗产生负面影响。此外，纳米酶在血液循环中的捕获可能导致诊断过程中的假信号，损害正常组织。因此，设计具有高效率和生物安全性的可控纳米酶显得尤为重要。

普鲁士蓝纳米酶具有强大的抗氧化活性，包括过氧化物酶样活性、过氧化氢酶样活性和超氧化物歧化酶样活性，对于调节疾病中的氧化应激至关重要。它们能在肿瘤部位分解过氧化氢生成氧气，缓解肿瘤缺氧并抑制转移。同时，普鲁士蓝纳米酶能去除体内过多的活性氧种（ROS），用于治疗ROS相关疾病。由于其卓越的近红外（NIR）吸收和光热转换效率，普鲁士蓝纳米颗粒也被广泛用作光热治疗（PTT）的光热剂。重要的是，普鲁士蓝纳米酶能缓解PTT过程中的炎症，防止过度热疗引起的损伤。然而，普鲁士蓝纳米酶的功能不能特异性地与肿瘤结合，传统的PA对比剂在诊断过程中可能产生假阳性信号。因此，设计能特异性结合肿瘤、可切换响应的PA对比剂是一个常用的策略。在肿瘤微环境（TME）中，谷胱甘肽（GSH）是细胞和组织中含量最丰富的内源性活性小分子，对生命活动和维持氧化还原平衡起着重要作用。基于此，研究者设计了用于癌症治疗和肿瘤缺氧缓解的纳米药物ISSzyme。当ISSzyme与肿瘤中高度表达的GSH反应时，可以在体内现场合成PB纳米酶。瘤内生成的PB纳米酶具有过氧化物酶样活性，可以分解H2O2生成O2，以缓解肿瘤缺氧并抑制转移。

图1 ISSzyme 特异性结合肿瘤引导光热治疗（ PTT）
以及缓解肿瘤缺氧的过程示意图。

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体外响应性验证

为了研究ISSzyme对GSH的响应性，在不同浓度GSH存在的条件下对ISSzyme溶液的吸光度和PA振幅进行了测量。结果显示，随着GSH浓度的增加，ISSzyme在700 nm处的吸光度和PA振幅均呈线性增加，而在990 nm处的PA振幅基本保持不变。这表明可以通过700 nm和990 nm的PA振幅比值（PA700/PA990）进行比率成像，该比值随着GSH浓度的增加而显著增加，从零浓度的10±3增加到饱和值的48.7±0.9，显示出4.87倍的增加。此外，体外光热能力评估实验中，ISSzyme溶液在GSH存在下经NIR激光照射后，温度升高与GSH浓度呈明显相关。这表明ISSzyme能够有效地响应GSH，并通过比率PA成像和光热效应在体外显示出显著的特性变化。

图2
ISSzyme酶的特性

(A和B) ISSzyme的的代表性TEM图像（A）和经GSH处理的ISSzyme（B）。(C) GSH共培养前后ISSzyme中K和Fe的EDS元素映射。(D) 添加GSH后ISSzyme溶液的照片（0-8 mM，5分钟）。(E) 不同浓度GSH加入时ISSzyme的紫外-可见吸收光谱。(F) ISSzyme的比吸收信号（Abs700/Abs990）随GSH浓度的变化。(G) 不同浓度GSH存在下ISSzyme的PA图像。样品在700和990 nm处记录，分别用绿色和红色表示。(H) 随GSH浓度变化的ISSzyme比PA信号（PA700/PA990）的量化。(I) 经GSH（从0至20 mM）处理的ISSzyme在照射前后的体外红外热图（808nm，0.8 W cm−2，5分钟）。(J) (I)中相应的光热加热统计数据。(K) 缺乏（对照）或不同氨基酸存在下（10 mM）ISSzyme的比吸收信号（Abs700/Abs990）。(L) ISSzyme的ICP-OES测量。(M) 不同处理条件下ISSzyme的氧气产生时间进程。

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体外细胞毒性和缺氧缓解实验

实验评估了ISSzyme对4T1乳腺癌细胞的光热治疗效果。结果显示，随着ISSzyme浓度的增加，4T1细胞的活力逐渐降低。当ISSzyme浓度达到200 mg mL-1时，经NIR激光照射后，细胞活力显著降低至8.54%。进一步的实验表明，ISSzyme处理后的细胞活力与照射功率密度和时间呈负相关，表明ISSzyme具有快速稳定的光热转换能力。体外抗癌能力评估显示，单独的照射治疗或ISSzyme治疗均无显著抗癌效果，但二者联合使用时，细胞活力显著降低。活死细胞染色和流式细胞术结果进一步证明了ISSzyme的有效光热治疗（PTT）能力和对细胞凋亡的影响。此外，ISSzyme处理能够缓解肿瘤缺氧并抑制肿瘤转移，表现为缺氧条件下培养的肿瘤细胞侵袭性降低，以及相对转移细胞数量的显著减少。综上所述，ISSzyme作为一种光热治疗剂，能够在体外有效抑制肿瘤生长和转移，联合照射治疗展现出更强的抗癌潜力，其机制涉及光热转换、氧气的现场产生以及细胞凋亡的诱导。

图3
体外 ISSzyme 介导的细胞毒性和缺氧缓解实验结果(A) 4T1细胞在不同浓度的ISSzyme下经过近红外线照射后的存活率 (n = 4)。(B) 4T1细胞在相同浓度ISSzyme处理后后在不同照射条件下的存活率 (n = 4)。(C和D) 不同处理的4T1细胞的存活率 (C) 和 calcein-AM/PI 染色 (D) (ISSzyme/PBS, 有/无照射， n = 4)。(E) 不同处理的4T1细胞中[Ru(dpp)3]Cl2的荧光图像 (ISSzyme/PBS, 缺氧/常氧， n = 4)。(F) 4T1肿瘤细胞的侵袭能力实验。(G) 不同处理后4T1细胞中[Ru(dpp)3]Cl2的定量。(H) 不同处理后4T1细胞的相对转移数量定量。(I) 不同处理的4T1细胞流式细胞术凋亡/坏死的定量分析。(J) 基于Annexin V-APC/PI染色实验的不同处理的4T1细胞流式细胞术凋亡/坏死分析。

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小鼠体内实验

体内实验验证了ISSzyme的光声成像能力。在BALB/c小鼠背部植入两个4T1异种移植肿瘤，分别注射ISSzyme和PBS作为对照。使用PACT系统在不同时间点记录PA图像，结果显示ISSzyme处理肿瘤的信号随时间显著增加，而PBS对照组几乎没有变化。定量分析表明，ISSzyme处理肿瘤的PA信号显著高于PBS对照组。进一步的实验中，ISSzyme通过系统性给药，皮下4T1肿瘤模型在PACT下成像，结果显示在注射后约10小时，肿瘤部位的PA振幅达到最大，PA信号的增加归因于ISSzyme在肿瘤中的积累。体内荧光实验结果与光声成像结果一致，进一步证明了ISSzyme与GSH反应，在肿瘤部位产生可检测的PA信号变化，提供了高灵敏度和特异性肿瘤成像的有效方法。综上所述，ISSzyme能够有效地在肿瘤部位产生PA信号变化，展现出优异的靶向性和特异性，为肿瘤成像提供了新的可能性。

图4
ISSzyme辅助的肿瘤PAI(A) 4T1肿瘤小鼠在皮下注射PBS和ISSzyme后0.5、2、4和6小时的典型PA图像。(B) 注射PBS或ISSzyme后以时间为函数的PA700/PA990量化结果数据图（n = 3）。(C) 4T1肿瘤小鼠在静脉注射ISSzyme前后的典型PA图像，分别于2、4、6、8、10、12和24小时拍摄。(D) 注射ISSzyme后的PA700/PA990量化柱状图（n = 3）。(E) 4T1肿瘤小鼠在注射ISSzyme前后的代表性体内PAMe成像（700 nm）结果的水平和垂直最大强度投影；白色虚线：肿瘤，红色虚线：ISSzyme。(F) 系统给药前后肿瘤部位的PA700/PA990量化。(G) 通过PAMe观察ISSzyme在肿瘤中的空间分布

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肝脏积累能力验证

通过系列PAI实验，该研究验证了ISSzyme在肝脏中的积累能力。在4T1皮下肿瘤模型中测量了ISSzyme和PB纳米酶在肝脏与肿瘤中的积累情况。给药后10小时，利用PACT技术记录了不同波长下的肝脏和肿瘤横截面图像。结果显示，ISSzyme和PB纳米酶在肿瘤和肝脏中均有积累，且ISSzyme诱导的信号变化与PB纳米酶相似。定量分析显示，ISSzyme和PB纳米酶处理的肿瘤PA信号比对照组显著增强。具体来说，ISSzyme处理的肿瘤PA信号是对照组的2.07倍，而PB纳米酶处理的肿瘤PA信号是对照组的1.44倍。在肝脏部位，PB纳米酶的积累导致光衰减增加，而ISSzyme处理组的肝脏特征丰富度与对照组相当。进一步的PACT成像实验表明，ISSzyme能够有效地区分肿瘤和健康肝脏组织。治疗后，ISSzyme处理的肿瘤PA信号显著增加，而PB纳米酶处理的肿瘤PA信号无明显变化。这些结果证实了ISSzyme在肝脏中的积累能力，以及其对肿瘤和健康组织的区分能力。综上所述，ISSzyme在肝脏中的积累能力及其对肿瘤与健康组织的区分能力在PAI实验中得到了验证，这为其在临床前和临床应用中的进一步研究奠定了基础。

图5
ISSzyme的肝脏积累特性(A) 皮下注射PBS、PB纳米酶和ISSzyme后10小时，小鼠的典型PA图像，展示4T1肿瘤和肝脏横截面（n = 3）。(B) 注射PBS（左列）和PB纳米酶/ISSzyme（右列）后10小时，小鼠右侧肝脏叶的PAMe成像的最大强度投影。(C) 系统给药后皮下4T1肿瘤和肝脏横截面的PA700/PA990量化数据柱状图。(D) 系统给药后PA肿瘤/PA肝脏的量化数据柱状图。(E) 小鼠右侧肝脏叶的相对PA信号量化数据柱状图。(F) 注射PB纳米酶或ISSzyme后10小时，小鼠肝脏横截面（绿色虚线）和4T1肿瘤肝脏转移（白色虚线）的代表性PA图像。(G) 注射PBS、PB纳米酶和ISSzyme后10小时，小鼠右侧肝脏叶和4T1肿瘤肝脏转移（虚线）的PAMe成像结果。(H和I) 给药前后4T1肿瘤肝脏转移（H）和肝脏（I）的PA700/PA990量化数据柱状图。(J) 给药前后4T1肿瘤肝脏转移和肝脏的PA肿瘤/PA肝脏量化数据柱状图。

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对肿瘤缺氧缓解验证

为了评估ISSzyme缓解肿瘤缺氧的效率，研究检测了4T1肿瘤小鼠中HIF-1a的表达水平。与对照组和激光处理组相比，接受ISSzyme治疗的动物显示出较低的HIF-1a红荧光强度，表明ISSzyme能够有效减轻缺氧状况（见图6D）。定量分析进一步证实了这一点，ISSzyme联合激光处理组的HIF-1a表达大约只有对照组的12.17%（图6C），这表明ISSzyme治疗促进了现场合成的PB纳米酶分解H2O2，释放的O2有助于改善肿瘤缺氧。在治疗后的第11天对4T1肿瘤的肺转移进行了评估，以确定转移抑制的效果（图6E）。在对照组和激光处理组中，肺部普遍存在转移肿瘤，而ISSzyme处理组在肺部表现出很少甚至没有转移的迹象。此外，通过H&E染色观察转移病变，对照组和激光组中的转移灶细胞染色明显，而在ISSzyme处理组中转移灶难以被观察到。该研究利用多光谱3D PAMe技术监测了肿瘤治疗前后的血液氧饱和度（SO2）。分析表明，现场合成的PB纳米酶显著改善了缺氧状况（图6F）。综上所述，ISSzyme能有效抑制乳腺癌的肺转移，其效果得益于现场合成的PB纳米酶对缺氧的缓解作用。

图6
体内治疗和肿瘤缺氧缓解示意图(A 和 B) 不同治疗后不同组别的肿瘤生长曲线 (A) 和体重 (B)。(C) 不同治疗后的相对HIF-α表达量。(D) 不同治疗后切除的肿瘤切片的光镜病理分析，包括苏木精-伊红染色、TUNEL试验、Ki-67染色和HIF-α染色。(E) 不同治疗组别肺转移的图片和H&E染色的肺切片。(F) 接受ISSzyme治疗后0小时和10小时收集的SO2的3D PAMe图像。

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总结

通过与传统PB纳米酶的比较，本研究验证了现场合成纳米酶的可行性。新型纳米酶ISSzyme不仅保留了传统PB纳米酶的肿瘤治疗和缺氧缓解作用，而且在代谢器官如肝脏中的积累最小。ISSzyme能够响应肿瘤微环境中的GSH，实现光声成像引导的光热治疗（PAI-PTT），同时在治疗过程中减少对正常组织的损伤。ISSzyme是一种创新的纳米药物，用于癌症治疗和肿瘤缺氧缓解。当ISSzyme与肿瘤中高表达的GSH反应时，可在体内原位合成PB纳米酶。这种内生成的PB纳米酶具有过氧化物酶样活性，能分解H2O2产生O2，缓解肿瘤缺氧并抑制转移。PB纳米酶对NIR的光吸收特性使ISSzyme成为PA引导PTT的理想药物。ISSzyme对GSH的高度敏感性和特异性有助于减少假阳性图像信号和治疗副作用。其“无肝脏积累”特性不仅减少了肝脏和其他代谢器官的损伤，还有助于从强烈的内源性背景中识别肿瘤。在体外和体内评估中，ISSzyme均表现出高生物相容性。综上所述，ISSzyme的现场合成纳米酶策略为未来人工酶的设计和应用提供了新的思路和启示。

DOI：10.1016/j.isci.2023.106066.

来源：iScience.
2023 Feb 17; 26(2): 106066.

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